Stanica na biočipu otkriva ponašanje proteina

Godinama znanstvenici diljem svijeta sanjali su o stvaranju cjelovite, funkcionalne, umjetne stanice. Iako je ova vizija još uvijek dosta daleko od realizacije, mnogi postižu značajan napredak na različitim područjima.

Profesor Roy Bar-Ziv i njegov istraživački timu s Odjela za materijale i sučelja na Weizmann institutu nedavno su postigli značajan iskorak u ovom smjeru kada su uspjeli stvoriti dvodimenzionalni, stanici nalik, sustav na staklenom čipu. Ovaj sustav, kreiran od nekih od najosnovnijih bioloških molekula koje nalazimo u stanicama – DNK, RNK, proteina – izvršio je jednu od glavnih funkcija žive stanice: gensku ekspresiju, proces kojim se informacije pohranjene u genima prevode u proteine. Čak i više od toga, omogućio je znanstvenicima, predvođenim Yaelom Heymanom, da prikupe slike ovog procesa u nanometarskoj rezoluciji.

Sustav, sastavljen od staklenih čipova debljine samo 8 nanometara, baziran je na prijašnjem sustavu kojega su u Bar-Zivovom laboratoriju dizajnirali dr. Shirley Daube i njen bivši student dr. Amnon Buxboim. Nakon oblaganja fotoosjetljivim materijalom, čipovi su ozračeni fokusiranim zrakama ultraljubičastog svjetla, koje omogućava biološkim molekulama povezivanje sa supstancom na ozračenim područjima. Na ovaj način, znanstvenici su mogli precizno postaviti DNK molekule enkodirajući protein označen sa zelenom fluorescentnom oznakom u jednom području na čipu i antitijela koja “hvataju“ obojene proteine na suprotnom dijelu čipa.

Kada su znanstvenici pod fluorescentnim mikroskopom promatrali čip, uočili su da je područje u koje su postavili antitijela postalo sjajno zeleno. To je značilo da su se DNK instrukcije prepisale (transkribirane) u RNK molekule, koje su se potom prevele (translatirale) u fluorescentno zelene proteine. Zelene proteine su zatim uhvatila antitijela.

Sljedeće, znanstvenici su se zapitali može li njihov sustav reproducirati kompleksne strukturalne sastave prirodnih proteina. Ovoga puta, postavili su virusni gen na površinu čipa enkodirajući protein koji se može samo-sastaviti u nanocijev. Uz pomoć dr. Sharon Wolf iz Jedinice za elektronsku mikroskopiju, znanstvenici su pod elektronskim mikroskopom promatrali mnoštvo sićušnih cijevi kako se razvijaju iz područja na kojima su locirana antitijela.

Znanstvenici su zatim tražili način kako da proizvedu i zadrže veći broj proteina istodobno kroz ograničavanje svakog pojedinog proteina prema području na čipu gdje se nalazi njegov gen. Na gornjem dijelu čipa gdje su se nalazili DNK enkodirajući zeleni proteini, znanstvenici su dodali otopinu s drugim genom enkodirajući crveni protein. Crveni i zeleni proteini su se međusobno natjecali kako bi se povezali s antitijelima, stvarajući uređeno prostorno razdvajanje u kojem su antitijela najbliža zelenim genima imala najveću koncentraciju zelenih proteina, uz porast crvenih koncentracija na preostalim područjima.

„Pokazali smo da je moguće izgraditi proteinsku “proizvodnu liniju“ izvan stanice i koristiti je kako bismo promatrali širok spektar aktivnosti proteina.“ objašnjava Bar-Ziv. U budućnosti, primjena ovakvog sustava mogla bi se odmaknuti od promatranja proteina i njihove aktivnosti prema osiguravanju osnove za tehnike stvaranja kompleksnih, aktivnih proteinskih struktura po potrebi.

Rezultati ovog istraživanja su nedavno objavljeni u znanstvenom časopisu Nature Nanotechnology.
DNK čip, biočip ili genski čip, samo su neki od mnogih naziva za novu tehnologiju, u svijetu poznatu kao DNA mikropostrojima tehnologija, koja je zasnovana na principima poluvodiča i biotehnologije, a znanstvenicima omogućava mnogo bržu i efikasniju analizu gena. Naime, dok je tradicionalni pristup omogućavao analiziranje gena jednog po jednog, a dosadašnja su istraživanja pokazala da ljudski genom sadrži između 30 000 i 40 000 gena, DNA čip tehnologija omogućava analizu više tisuća gena u jednom postupku.

DNK čip predstavlja minijaturni sustav mikroskopskih DNK segmenata, raspoređenih prema mrežastom obrascu na površini čipa, nad kojima se provodi usporedna analiza hibridizacije. Osnovni princip funkcioniranja DNK čipa je upravo hibridizacija između dva DNK lanca (eng. strand), odnosno proces u kome se dva polinukleotidna lanca po principu komplementarnosti nukleotidnih baza povezuju vodikovim vezama.

Čip se sastoji od tisuća nukleotidnih sljedova (sekvenci), postavljenih na staklenom nosaču ili sintetičkoj membrani, koje funkcionirajući kao probe (eng. probe), odnosno reporteri, znanstveniku koji provodi analizu pokazuju da li testni uzorak sadrži specifični DNK ili RNK slijed. Nukleotidne sekvence raspoređuju se tehnikom “spottinga“ ili direktnom sintezom na točno definirana mjesta na podlozi čineći tako sistematično oblikovana genska polja (eng. array), od kuda potječe i naziv mikropostrojima . Primjenom ove tehnologije omogućava se analiza velikog broja genetskih karakteristika u samo jednom eksperimentu.

Standardni genski mikropostrojski eksperiment u osnovi se sastoji od sljedećih koraka: 1.) izoliranje RNK iz uzorka koji se treba usporediti, 2.) reverzna transkripcija RNK uzorka u obilježene cDNK (komplementarna DNK), 3.) hibridizacija obilježenih cDNK s identičnim membranskim array-ima ili s array-ima na staklenim slajdovima, 4.) ispiranje nevezane cDNK, 5.) detekcija i kvantifikacija hibridiziranih cDNK, 6.) uspoređivanje kvantitativnih podataka iz različitih uzoraka.

Primjena DNA mikropostroja tehnologije pomaže znanstvenicima u identifikaciji novih gena, razumijevanju njihovog funkcioniranja i razina ekspresija pod različitim uvjetima. Također, osigurava bolji uvid u različite bolesti poput bolesti srca, mentalnih oboljenja, zaraznih bolesti te uvelike doprinosi istraživanju karcinoma.

DNA mikropostrojna tehnologija može omogućiti daljnju klasifikaciju tipova karcinoma prema obrascima genske aktivnosti u tumorskim stanicama te tako pomoći u razvoju učinkovitijih tretmanskih rješenja koja će biti usmjerena izravno na specifične vrste karcinoma.

Farmakoekonomika, znanstvena disciplina koja procjenjuje trošak i efekte farmaceutskog proizvoda, imat će velike koristi od mikropostroja tehnologije u kontekstu otkrića novih lijekova. Naime, komparativnom analizom gena s mrtve i žive stanice mikropostroja može pomoći u identifikaciji biokemijskog ustroja proteina sintetiziranih od mrtve stanice, te tako omogućiti sintetiziranje lijekova koji se bore protiv tih proteina, reducirajući tako njihov utjecaj.

Aplikacija DNK mikropostroja tehnologije važna je i u području toksikološkog istraživanja. Konkretno, mikropostroj osigurava široku platformu za istraživanje utjecaja toksina na stanice i njihovo prenošenje na potomstvo, kroz uspostavljanje korelacije između reakcija na toksikante i promjene u genetskom profilu stanica koje su izložene takvim toksikantima.

Iako je proizvodnja DNK čipa vrlo skup i sofisticiran proces, posebice stoga što je u slučaju humanog genoma potrebno na array-ju pojedinačno rasporediti i više od 30 000 gena, uporabom automatiziranih uređaja i robota troškovi ovoga procesa smanjuju. Analiza velikog broja informacija koje proizlaze iz mikropostroja eksperimenta obavlja se računalnim putem, pri čemu dobivene informacije bivaju uvrštene u baze podataka koje se automatski obrađuju.

Od početka razvoja u 90-im godinama prošlog stoljeća, DNA mikropostroj tehnologija je postala jedan od najvažnijih alata u otkrivanju ključnih informacija o genetskim faktorima koji su involvirani u razvoju mnogih bolesti, uključujući i različite oblike karcinoma.

Izvor: Wis Wander Weizmann